CRISPR/Cas9: una nueva herramienta para la modificación del gen de PTEN mediante RNA-guía
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Date
2016-07
Authors
Navaridas Fernández de Bobadilla, Raúl
Other authors
Dolcet Roca, Xavier
Institut de Recerca Biomèdica de Lleida
Universitat de Lleida. Escola Tècnica Superior d'Enginyeria Agrària
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Abstract
CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associated system) es un sistema de edición genómica que utiliza una endonucleasa derivada de la Cas9 bacteriana para introducir roturas de doble cadena en el DNA en lugares precisos del genoma usando un RNA guía complementario a la región diana. En este trabajo, se intenta desarrollar un knock-in en la línea celular HEK-293T, en donde la inserción del gen que codifica para la proteína de resistencia a la puromicina es producida por la recombinación homóloga directa (HDR) mediada por la Cas9 en el exón/intrón 1 del gen PTEN. PTEN (también conocido como MMAC1 o TEP1) codifica para una fostatasa dual de lípidos y de proteínas la cual actúa como supresor tumoral. Esta antagoniza la actividad de la PI3K defosforilando el fofatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3) a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato (PIP2). Usando este enfoque, comparamos dos estrategias para la creación de los brazos de homología a partir de los cuales se producirá la HDR, centrándonos en la variación de la longitud de estos brazos. Finalmente, obtuvimos una línea celular HEK-293T en la que la expresión del gen PTEN estaba suprimida y la vía PI3K/Akt/mTOR alterada. Concluimos que en nuestro caso, el sistema CRISPR/Cas tiene una mayor eficiencia y eficacia al usar los brazos de homología largos.